TFF tangencialna pretočna filtracija v kombinaciji z ultracentrifugiranjem za učinkovito pripravo majhnih zunajceličnih veziklov

Majhni zunajcelični vezikli (sEV) so nanometrski vezikli, ki jih izločajo celice in vsebujejo nukleinske kisline, proteine, majhne molekule in druge komponente ter igrajo pomembno vlogo pri medcelični komunikaciji. Majhni zunajcelični vezikli-tipa eksosoma imajo veliko podobnosti s svojimi matičnimi celicami. V primerjavi z umetnimi nanodelci imajo nižjo stopnjo imunskega očistka in manjšo citotoksičnost, zaradi česar so obetavni kandidati kot novivozila za dostavo zdravil in vivo. Skoraj vse vrste celic lahko izločajo te vezikle in raziskave njihove uporabe kot nosilcev zdravil se postopoma selijo iz laboratorija v klinične aplikacije. vendarvelika{0}}proizvodnja ostaja glavno ozko grlo.

 

Trenutne metode za izolacijo zunajceličnih veziklov

Trenutne metode izolacije zunajceličnih veziklov vključujejoultracentrifugiranje, centrifugiranje z gradientom gostote, -ekskluzijska kromatografija (SEC) in obarjanje s polietilen glikolom (PEG).

Obarjanje PEG nudi visok izkoristek in preprosto delovanje, vendar je povezano s precejšnjo kontaminacijo z nezaželenimi beljakovinami. Centrifugiranje z gostotnim gradientom in -izločitvena kromatografija lahko zagotovita visoko{2}}čiste produkte, vendar je njuna učinkovitost razmeroma nizka, postopki pa dolgotrajni-. Ultracentrifugiranje se pogosto uporablja, vendar je njegov obseg obdelave omejen z zmogljivostjo centrifuge, zaradi česar ga je težko povečati.

 

Uporaba filtracije tangencialnega toka za ločevanje sEV

Tangential flow filtration (TFF) je že bil uporabljen za ločevanje nanodelcev, kot so liposomi in lentivirusni vektorji. V TFF dovod teče tangencialno čez površino membrane, kar pomaga zmanjšati umazanijo membrane in omogoča lažjo razširitev postopka.

Ker majhni zunajcelični vezikli na splošno segajo od30–200 nmv premeru, a0,45 μm membranska kasetase lahko izbere v sistemu TFF za odstranitev večjih proteinov in veziklov, medtem ko a300 kDa membranska kasetase lahko uporablja za odstranjevanje beljakovin z majhno molekulsko-mato in koncentriranje majhnih zunajceličnih veziklov, ki so prisotni v gojišču.

 

Karakterizacija surovine po ločevanju TFF

Analiza sledenja nanodelcev (NTA) je pokazala, da so bili premeri delcev večinoma porazdeljeni znotraj območja0–250 nm.

 

 

Vendar pa je transmisijska elektronska mikroskopija (TEM) pokazala veliko količino kontaminirajočega proteina, medtem ko zunajceličnih veziklov niso opazili. Ti rezultati so pokazali, da je za nadaljnje čiščenje zunajceličnih veziklov potrebna dodatna stopnja čiščenja.

 

Karakterizacija koncentrata TFF po 100 kDa ultrafiltraciji

Koncentrat TFF je bil nadalje obdelan z uporabo a100 kDa ultrafiltracijska cev.

NTA je pokazala, da so premeri delcev v koncentratih, pridobljenih po enem in dveh krogih ultrafiltracije, ostali večinoma v območju0–250 nm. Vendar pa je dvakratna ultrafiltracija povzročila znatno zmanjšanje števila dobljenih delcev.

Analiza TEM je pokazala, da mehurčkom{0}}podobne strukture niso bile opažene ne v-ne ne v dvakratnih-koncentratih za ultrafiltracijo, medtem ko je ostala precejšnja količina kontaminantnih beljakovin.

zatoUltrafiltracije 100 kDa ni bilo mogoče učinkovito uporabiti za čiščenje gojišča kulture po koncentraciji TFF.

 

 

Karakterizacija koncentrata TFF, prečiščenega z ultracentrifugiranjem

NTA je pokazala, da so bili premeri delcev prečiščenih produktov večinoma porazdeljeni v območju od0–250 nm.

Pomembno je, da je TEM jasno razkril mehurčkom-podobne strukture v različnih vidnih poljih. Ti rezultati so pokazali, da po koncentriranju gojišča z uporabo TFF,ultracentrifugiranje se lahko naknadno uporabi za nadaljnje ločevanje in čiščenje zunajceličnih veziklov.

 

 

Karakterizacija sEVs, izoliranih iz gojišča, kondicioniranega z mezenhimskimi matičnimi celicami, z uporabo TFF v kombinaciji z ultracentrifugiranjem

NTA je pokazala, da so bili premeri delcev prečiščenih produktov večinoma porazdeljeni v območju od0–250 nm.

Strukture, podobne mehurčkom,- so opazili s TEM. Western blot analiza je pokazala pozitivno izražanje proteinov,-povezanih z zunajceličnimi vezikliCD9, CD63 in ALIXv očiščenih zunajceličnih veziklih.

Ti rezultati so potrdili, da očiščeni majhni zunajcelični vezikli vsebujejo eksosome, kar kaže, da se ta metoda lahko uporablja tudi zaizolacija in ekstrakcija eksosoma.

 

 

Zaključek: TFF v kombinaciji z ultracentrifugiranjem za visoko{0}}kakovostno pripravo sEV

Študija je to dokazalaSama koncentracija TFFje povzročilo produkt, ki je vseboval precejšnjo količino kontaminantnih beljakovin in je bil zato nezadosten za pridobitev kvalificiranih zunajceličnih veziklov.

Podobno z uporabo a100 kDa ultrafiltracijska cev za sekundarno čiščenjeni učinkovito prinesel nedotaknjenih struktur veziklov.

S kombiniranjem koncentracije TFF z naknadnim čiščenjem z ultracentrifugiranjem je mogoče integrirati prednosti obeh tehnik, da dobimovisoko{0}}kakovostni izdelki majhnih zunajceličnih veziklov.

V primerjavi s samo običajnim ultracentrifugiranjem lahko kombinirani postopek učinkovitozmanjšati skupni čas obdelave in izboljšati učinkovitost ločevanja.

V tem poteku delaTFF omogoča hitro obogatitev velikih{0}}vzorcev, ki obravnava omejitev običajnega ultracentrifugiranja pri obdelavi velikih količin vzorcev. Ultracentrifugiranje nato izvede globoko čiščenje, da odstrani ko-koncentrirane beljakovinske nečistoče, hkrati pa pomaga ohraniti čistost in celovitost veziklov.

Poleg tega postopek ne zahteva dodajanjaeksogeni kemični reagenti za obarjanje, kar pomaga ohranjati biološko aktivnost veziklov v največji možni meri.

Z vidika industrijskega prevajanja je ta proces pomembenpovečanje potenciala-in lahko pomaga pri reševanju izzivov, povezanih z-veliko obsegom proizvodnje zunajceličnih veziklov zadostava zdravil, regenerativna medicina in s tem povezan razvoj izdelkov. Zagotavlja tudi trdno eksperimentalno osnovo za kasnejšo optimizacijo procesa in pilotno-proizvodnjo.

 

Referenca

Wang Ling, Li Mengshi, Xu Sha, et al.Vzpostavitev metode za ločevanje majhnih zunajceličnih veziklov s tangencialno pretočno filtracijo v kombinaciji z ultracentrifugiranjem. Kitajska biološka revija, 2022, 35(9): 1096–1101. DOI: 10.13200/j.cnki.cjb.003713.